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Bone marrow hematopoiesis drives multiple sclerosis progression
作者：KaibinShi, HandongLi, TingChang ,WenyanHe , YingKong , CaiyunQi , RanLi , HuachenHuang , ZhibaoZhu , PeiZheng , ZheRuan , JieZhou , Fu-DongShi , QiangLiu（Department of Neurology, Institute of Neuroimmunology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China）
发表情况：Cell.2022 Jun 23;185(13):2234-2247.e17.
doi: 10.1016/j.cell.2022.05.020. Epub 2022 Jun 15.
科学问题
多发性硬化症（MS）是一种T细胞介导的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病。对于多发性硬化症发病机制的研究多局限于外周血和脑脊液的自身反应性T细胞，骨髓在其中的作用仍然未知。
科学亮点
1.多发性硬化症患者表现出显著的骨髓增生；
2.自身反应性 T 细胞以CXCL12-CXCR4 轴依赖性方式迁移到骨髓隔室；
3.自身反应性 T 细胞增加骨髓的生成，这种异常的骨髓生成涉及中枢神经系统炎症损伤。
中文摘要
多发性硬化症（MS）是一种T细胞介导的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病。骨髓造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 可快速感知免疫激活，但它们与多发性硬化症中自身反应性T细胞的潜在相互作用尚不清楚。在这里，研究者报道了在多发性硬化症患者中，骨髓HSPC偏向骨髓谱系，T细胞异常扩增。
通过对自身免疫性脑脊髓炎小鼠（多发性硬化症小鼠模型）谱系追踪证实了小鼠具有异常的骨髓增生，伴随有显著增加的中性粒细胞和 Ly6Chigh单核细胞侵入中枢神经系统。研究者发现髓鞘反应性T细胞以CXCR4依赖性方式优先迁移到骨髓隔室。这种异常的骨髓生成涉及 CCL5-CCR5 轴并增加中枢神经系统炎症和脱髓鞘。该研究表明，靶向骨髓生态位为治疗多发性硬化症和其他自身免疫性疾病提供了一条有效途径。
英文摘要
Multiple sclerosis(MS) is a T cell-mediated autoimmune disease of the central nervous system (CNS). Bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) rapidly sense immune activation, yet their potential interplay with autoreactive T cells in MS is unknown. Here, we report that bone marrow HSPCs are skewed toward myeloid lineage concomitant with the clonal expansion of T cells in MS patients. Lineage tracing in experimental autoimmune encephalomyelitis, a mouse model of MS, reveals remarkable bone marrow myelopoiesis with an augmented output of neutrophils and Ly6Chigh monocytes that invade the CNS. We found that myelin-reactive T cells preferentially migrate into the bone marrow compartment in a CXCR4-dependent manner. This aberrant bone marrow myelopoiesis involves the CCL5-CCR5 axis and augments CNS inflammation and demyelination. Our study suggests that targeting the bone marrow niche presents an avenue to treat MS and other autoimmune disorders.
结果
图1：骨髓细胞谱系的单细胞RNA测序揭示MS患者的异常骨髓生成
(A) 对来自MS患者和健康对照个体的骨髓细胞进行单细胞测序和流式细胞术分析的实验设计。
(B)HSPC和下游细胞谱系的方案 (左)，UMAP 图（中）和汇总百分比（右），共 108,983 个细胞，包括 HSPC、骨髓细胞、淋巴样细胞和红细胞。
(C) 10个具有细胞类型注释的集群力导向图。
(D)MS患者与对照组细胞百分比的log 2倍数。
(E)对照组和MS组细胞的22,649个HSPC的力导向图（左）和小提琴图（右）表明HSC的干性分数。（HSC，造血干细胞；CMP，髓共同祖细胞；GMP，粒细胞-单核细胞祖细胞；MDP，单核细胞-树突状细胞祖细胞；CLP，共同淋巴祖细胞；NP，中性粒细胞前体；MP，单核细胞祖细胞）。
(F)热图显示与对照组相比MS患者在80%-90%的stemness评分范围内GMP和MDP相关基因模块的表达。
(G)调节子活性评分分析MS 患者HSC中与骨髓分化相关的转录因子的表达。
(H)通过t-SNE 的多维还原聚集的骨髓细胞显示T细胞亚群（对照：来自 7 名受试者的 10,266 个细胞；MS：来自 7 名受试者的 7,246 个细胞）。
(I)T细胞簇位置克隆细胞的浓度。
(J)骨髓T细胞亚群进行分类标志物的表达。
(K)TCRαβ克隆图表明MS患者的细胞克隆增强。
(L)MS患者（% TCRαβ 序列）最大克隆的量化值。
(M)MS患者与对照组CD4 + T细胞（克隆TCRαβ ≥ 2）的差异表达分析。
(N)MS患者与对照组克隆CD4 + T细胞差异表达基因的通路分析。
图2: 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠骨髓HSC的数量和活性增加
(A) 流式细胞检测骨髓 HSC的门控策略。
(B) 在指定时间点检测EAE小鼠股骨骨髓中HSC的数目。
(C) BrdU检测HSC的增殖情况。
(D)椎骨和股骨骨髓的 18F-FDG PET-CT 图像。
(E)流式细胞术评估HSC数目及其与BrdU的结合检测接受不完全弗氏佐剂 (IFA)、完全弗氏佐剂 (CFA) 和百日咳毒素 (PT)、IFA + PT、CFA + PT、OVA323-339 免疫或 MOG35-55 免疫的小鼠HSC的增殖情况。
(F)流式细胞术分析3个月的幼稚 OT-II 小鼠（OVA323-339 特异性 TCR 转基因）和幼稚2D2小鼠（MOG35-55 特异性 TCR 转基因）中的 HSC数量。
图3：EAE小鼠骨髓中的骨髓生成增加
(A) 骨髓常见淋巴祖细胞，常见骨髓祖细胞，粒-单核祖细胞和单核-树突状祖细胞的流式细胞术门控策略。
(B) 在指定时间点EAE小鼠股骨骨髓中祖细胞的频率和数目。
(C) 免疫后指定时间点骨髓中下游骨髓细胞和淋巴细胞的流式细胞术分析。
图4：EAE小鼠骨髓中性粒细胞和Ly6Chigh单核细胞的造血功能增强
(A) 示意图展示骨髓 HSC、下游祖细胞、骨髓细胞和淋巴细胞的谱系追踪。
(B) 流式细胞图显示14dpi时指定组tdTomato表达的HSC。
(C) 在7、14和28 dpi时对表达 tdTomato的HSC和下游骨髓/淋巴祖细胞的定量分析。
(D) 流式细胞仪图显示14 dpi 时骨髓中表达 tdTomato 的中性粒细胞和Ly6Chigh单核细胞。
(E)在指定时间点检测骨髓中表达 tdTomato 的中性粒细胞、Ly6Chigh单核细胞、树突状细胞、B 细胞和 T 细胞的数目。
(F-H)脾脏（F）、血液（G）、脑和脊髓组织（H）中表达 tdTomato 的中性粒细胞和 Ly6Chigh单核细胞的数目。
图5: 髓鞘反应性 T 细胞优先归巢于骨髓并诱导骨髓生成
(A) 流式细胞术检测14 dpi时小鼠血液、脾脏、淋巴结、骨髓、大脑和脊髓中 MOG 35 – 55特异性CD4 + T细胞的百分比。
(B) 在指定时间点 EAE 小鼠股骨骨髓中MOG 35 – 55特异性CD4 + T细胞的百分比。
(C) 实验设计示意图。
(D) 流式细胞术评估归巢至股骨骨髓的转移 (GFP+) CD4 + T细胞。
(E) 从UBC-GFP EAE小鼠的脾组织中分离出CD4 + T细胞，并在体外敲低CXCR4，然后将 2 × 10 6 CD4 + T细胞静脉注射到受体 Rag2 -/-小鼠中。通过流式细胞术在受体 Rag2 -/-小鼠中检测GFP+ CD4+ T细胞。
(F) 进行流式细胞术分析移植后第 7 天受体小鼠的骨髓细胞。
(G) 流式细胞术检测在受体 Rag2 -/-小鼠中的2D2 T细胞。
(H) 受体Rag2 -/-小鼠股骨骨髓中HSC的计数及其 Ki67 的表达。
(I) 受体Rag2 -/-小鼠股骨骨髓中 GMP、MDP、中性粒细胞和Ly6Chigh单核细胞的计数。
图6: 髓鞘反应性T细胞使骨髓HSC偏向髓细胞谱系涉及CCL5-CCR5轴
(A) 热图显示从幼稚2D2小鼠股骨骨髓中分选的2D2 CD4 + T细胞表达的免疫因子。
(B)流式细胞术分析 2D2小鼠或野生型小鼠骨髓、脾脏和淋巴结2D2 CD4 + T细胞中CCL5的表达情况。
(C)从 2D2 小鼠和野生型小鼠的股骨骨髓中分选出HSC的转录组图谱，热图表明变化基因的Z值。
(D) 流式细胞仪图和条形图表明 2D2 或野生型小鼠组的骨髓 HSC中CCR5的表达量上调。
(E) 单细胞测序分析表明，MS患者骨髓中表达CCL5的T细胞和表达CCR5的 HSC的数目增加。
(F) 实验设计示意图。
(G) 流式细胞术分析si CCL5处理后CD4 +T细胞中CCL5表达情况。
(H) CCL5敲低后受体小鼠骨髓中2D2 CD4 +T细胞的百分比。
(I)流式细胞术分析CCL5敲低后受体小鼠中HSC、GMP、MDP、中性粒细胞和Ly6Chigh细胞。
图7：CCL5-CCR5轴的破坏抑制骨髓生成、神经炎症和神经功能缺损
(A) 实验设计示意图。
(B)流式细胞术分析接受2D2 CD4+T细胞或幼稚野生型CD4+T细胞后小鼠骨髓中CD45.2+的HSC细胞。
(C) 流式细胞术分析接受2D2 CD4+ T细胞后小鼠CD45.2+的下游骨髓祖细胞。
(D&E) 流式细胞术分析接受2D2 CD4+ T细胞的小鼠骨髓 (D)、脑和脊髓 (E)中 CD45.2+中性粒细胞和Ly6Chigh单核细胞。
(F) 对分别接受CCR5 +/+ Lin -细胞或CCR5 -/- Lin -细胞然后注射2D2 CD4+T细胞的小鼠进行临床评分。
(G) 小鼠脊髓组织切片H&E和Luxol Fast blue染色。
总结
多发性硬化症病因学的主要研究集中在中枢神经系统的自身反应性T 细胞上，这些T细胞一旦进入中枢神经系统就会重新激活并引发炎性脱髓鞘病变。尽管越来越多的证据表明中性粒细胞和单核细胞在多发性硬化症期间会继发中枢神经系统炎症，但这些血源性细胞的起源仍然未知。
这项研究报道了骨髓可调控中枢神经系统炎症和自身免疫损伤传播，赋予骨髓一个未被认知的功能。然而，研究者还没有得出结论性证据，证明中枢神经系统周围骨髓与股骨骨髓对中枢神经系统炎症损伤的影响。此外，多发性硬化症骨髓异常增生后T细胞的扩增和TCR Vβ应用的机制还需要进一步研究。
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